甲基化检测-高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melt,HRM)

甲基化检测-高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melt,HRM),高分辨率熔解(High Resolution Melt, HRM)是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG 位点的一种新技术,主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性,应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析,其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

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2016年10月07日

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实时荧光定量检测-相对定量Q-PCR

 

 HRM实验原理:

    高分辨率熔解(High Resolution Melt, HRM)是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG 位点的一种新技术,主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性,应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析,其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。由于每一段DNA都有其独特的序列,因而也就有了独特的熔解曲线形状,如同DNA指纹图谱一样,具有很高的特异性、稳定性和重复性。在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。


 

HRM实验流程:

基因组DNA制备, 亚硫酸氢盐修饰,DNA纯化与回收,HRM PCR扩增, 检测

 

优点:

    1、不受碱基位点局限,同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点;

    2、敏感性高,待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测;

    3、成本低廉、时间少、误差小、高通量检测。

 

缺点:

    1、存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性;

    2、不能够精确检测甲基化的具体位点;

    3、对低水平的DNA甲基化敏感性低。

 

送样要求:

    1、组织样本:-20℃或-80℃低温冰箱中保存,液氮或者干冰运输;市内或短途运输可冰袋运输。若提供的材料为新鲜组织、血液细胞等生物材料,请提供足够提取2ug以上基因DNA的材料量。

    2、DNA样本:体积≥20ul,浓度≥100ng/ul,DNA总量≥2ug,20℃保存,低温冰袋运输。

    3、血液样本:要求保存于抗凝管中或冻存管中,体积大于2ml,请用干冰运送,保证DNA。

 

HRM 的应用:

 

1、基因的突变扫描:检测杂合子SNP、区段/碱基缺失、前后重复、杂合子缺失相关研究方向:样本中特定突变位点(SNP)的筛查;疾病相关基因(癌基因)特定区段突变位点的扫描,新突变的发现;遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现;植物抗逆性,突变与性状关联性的研究;动植物品质相关多态性位点的研究等。

 

2、基因组配型:器官移植的HLA 配型、同胞之间HLA 基因型确定应用举例:快速确定HLA 高度多态性位点的类型,及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA 基因型确认。

 

3、等位基因频率分析:SNP 频率分析

 

4、物种鉴定、品种鉴定:微生物品种、物种快速鉴定;动植物品种鉴定应用举例:临床细菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行16SrRNA 的实时扩增,并进行HRM 分析,每个菌种的熔解曲线模式就如果该物种的分子指纹,从而可以根据HRM 的不同对细菌进行鉴

(来源:http://www.newbiosci.com)




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