甲基化整体研究思路

甲基化整体研究思路,DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。

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2016年10月10日

外泌体——蛋白质组学研究方案

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  简单概况:

   DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。牛启生物研究这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA甲基化状态与生长发育调控及生理状态密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则程高度的甲基化状态,导致抑癌基因表达的下降。


  原核生物中甲基化多发生在CCA/TGGGATC序列;真核生物中DNA甲基化一般发生在CpG位点上;哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶,植物甲基化发生在CpGCpNpG。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶,CpG位点在基因组是不常见的,主要密集于接近基因启动子的位置,统称为CpG岛。CpG位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。


哺乳动物中,CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%,远低于的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中CpG序列密度很高,可以达均值的5倍以上即所谓的CpG岛。通常,CpG岛大约含有500多个碱基,位于基因的启动子区或第一个外显子区。 在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛,而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。


 

成功案例:

    北大医院、深圳市第三人民医院、哈尔滨医科大学、中国疾病预防控制中心、中国农业大学、北京协和医院、太原中心医院、第三军医大学、天津总医院、广东医学院附属医学院、宁夏医科大学、淮安市第二人民医院、江苏省人民医院、大连医学院附属第二医院、广东医学院病理教研室、医科院病原所、温州医学院、华南理工大学、山东大学、中国医科大学附属第一医院、深圳市中医院等。

 

 

甲基化研究思路:

 

1. 寻找甲基化位点

    1) 甲基化二代测序寻找甲基化位点;

    2) 对照组和实验组进行甲基化芯片检测,找到相关的甲基化位点;

    3) 一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象,可预测该基因是否存在CpG岛;

    4) 根据文献寻找相关基因的甲基化位点。

 

2. 验证甲基化位点,并进行甲基化程度分析

    采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。

    1) MSP方法:可进行特定位点甲基化验证,适用于甲基化芯片后的结果,无法进行甲基化程度分析;

    2) BSP克隆测序法:验证某些相关基因的甲基化位点,并计算出精确的甲基化程度百分比;

    3) HRM法:适用于大批量样本甲基化验证,并能计算出甲基化程度范围;

    4)焦磷酸测序法: 验证某些相关基因的甲基化位点,并计算出精确的甲基化程度百分比。

 

3. 分析甲基化位点与研究的相关性

    根据对照组和实验组样本的检测结果,分析与研究的相关性。

    1) 比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异;

    2) 比对对照组合实验组相同基因启动子区甲基化程度是否有差异;

 

4. 验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化

    采用荧光定量PCR的方法检测相关基因的表达量,如果表达量降低,可能由于启动子区发生甲基化导致的,从而影响该基因所在的某些通路,导致一些疾病,或表型发生变化;如果没有发生变化,可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切,从而不会影响基因的表达。



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