让您了解如何提取外周血单核细胞 PBMC

2017-10-08

如何提取外周血单核细胞 PBMC


PBMC(peripheral blood mononuclear cell),外周血单个核细胞,顾名思义,其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞,主要包括淋巴细胞(T\B),单核细胞,吞噬细胞,树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离PBMC的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除,从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

  Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,平均分子量为400,000,当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞。

一 、试剂

  • 全血 (以10ml为例)

  • 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水

  • 蔗糖溶液(Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)

  • RPMI 1640培养基 (Invitrogen)

  • 胎牛血清(FBS)(GIBCO)

  • 双抗P/S (Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)

  • 二甲亚砜(DMSO)(SIGMA)

  • 预先装好异丙醇的冻存盒



二、实验步骤


配制所需的溶液:

a. 细胞培养基:RPMI 1640+10% FBS+1% P/S;

b. 细胞冻存液:FBS中加入10%DMSO;



将10ml全血转入50ml离心管中,加入10ml PBS溶液稀释,轻轻混匀;


取两支15ml离心管,先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层,一定要轻柔,避免两种溶液混合在一起,每只离心管各10ml稀释血液;


2,000rpm,20min,注意,降速设置中一定要设置成no break,或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层;


PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。


加入PBS至10-15ml,1,500rpm,10min离心后去掉上清,再加入培养基进行相同操作的清洗;


加入5-10ml培养基重悬细胞,进行后续计数培养或者铺板;


细胞冻存:将细胞离心收集之后,用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中,放入冻存盒(冻存盒可事先在4℃冰箱预冷)。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。


三、注意事项


全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层,但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候,一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。


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